低温罐：通过去除绝缘真空引发故障后，温度和体积随时间损失
液氮杜瓦于1892年以其发明者詹姆斯·杜瓦的名字命名。如今，该设备最常用的内涵是液氮(LN2)罐，在世界上几乎每个生殖(人类和非人类)实验室都有几种设计之一。现代液氮罐的设计源自1956年美国育种者服务局和美国氰胺公司林德分部合资开发的第一个实用的胚胎储罐。在此之前，牲畜饲养者更常使用新鲜或冷却的胚胎。在胚胎冷冻保存变得可靠后，冷冻保存的胚胎用干冰储存——研究人员可用的液氮储存系统不可靠，需要频繁管理，例如密切监测和频繁填充。
现代液氮罐的设计与林德公司的设计相比没有太大变化;内罐(容纳液态气体和冷冻标本)悬挂在外壳内，周围有隔热层和真空空间。铝是建造小容量储罐最常用的金属，钢用于建造大容量储罐。
储罐的设计允许液态气体在内罐中储存，同时尽量减少热量暴露;因此，根据气体的不同，气体可以在接近-200°C或更低的温度下保持液态。液氮的工作温度约为-196°C，而干冰的温度约为-79°C。液氮罐还保持由温度接近液态的气体蒸气组成的相对静态的顶部空间(非液体)，即使液化气的体积减少。这种设计有助于保持气体和气体蒸汽体积之间相对稳定的内部动态。储罐未加压，蒸汽通过储罐的聚苯乙烯泡沫塑料盖/塞损失。这导致液氮缓慢但持续蒸发。液氮储罐的日常维护和填充时间表因实验室而异，可能涉及每日或每周检查、监测储罐重量、液化气液位/体积和/或顶部空间蒸汽温度。维护，例如监测和填充，可以是手动或自动的。过去，罐体不需要配备紧急呼叫报警系统。最近，提出了正确验证新储罐和报警器的指南以及质量控制指南。
液氮罐的设计——尺寸、形状、建筑材料、焊缝和密封剂——并不能绝对防止结构完整性的丧失。金属疲劳和结构应力会导致真空逐渐丧失，液氮的使用逐渐增加。液氮液位的逐渐变化是正常和预期的，液氮储罐的制造商宣布，最终所有储罐都会发生故障。小容量储罐最薄弱的区域之一是将储罐颈部连接到内室和外室顶部的焊缝。油箱的全部重量，通常约为75至100磅，都由这个颈部悬挂。这些颈部焊缝在大容量储罐中没有发现。
MVE 47/11液氮罐切开视图。请注意，整个油箱的重量由粘在内外油箱上的颈部支撑
由于内外容器之间突然出现不可预测的真空损失，储罐发生灾难性故障，可能导致液氮迅速损失，随着液氮的蒸发，储存内容物迅速升温。保持在临界玻璃化转变温度(约-130°C)以下的试样可能会暴露在更高的温度下，对细胞完整性造成不可逆转的损害，除非采取措施保护试样。
人类和动物生殖科学家讨论了液氮罐真空损失的轶事。描述包括储罐外部湿度增加时，储罐突然出现冷点、霜冻和水珠。也有报道称，从储罐中可以看到蒸汽羽流，在某些情况下，还会听到储罐发出的声音，当然，第二天或几天后发现储罐中几乎没有液氮。甚至有报道称，试样周围的内罐内爆，使其无法移除。
直到最近，文献中还没有关于真空损失以及液氮蒸发速率或储罐内腔温度变化的详细报告或任何研究。真空故障后，储罐能保持合适的温度多久，从检测故障到储罐达到临界温度有多长时间，甚至真空故障对储罐特性的影响都是未知的。
本研究是为了响应开发可操作数据的呼吁而开展的，这些数据可以(1)通过监测重量和内部蒸汽温度来证明不同设计(小型临床到大型商业储存)的储罐中的常规液氮损失，以及(2)记录由于外罐外壳的诱导破裂而导致的重量和内部蒸气温度的变化，从而在每个相同的储罐中突然失去真空。
这项研究将有助于根据储罐尺寸——蒸发率和温度变化——由储罐重量和悬挂在储罐颈部下方的校准探头监测——来表征灾难性真空损失后的液氮储罐行为，并记录对外部事件的观察结果，如霜霜、水珠、蒸汽羽流等。此外，目标是提供可操作的数据——气体体积损失率、顶部空间温度变化率——以使每个单独的实验室能够完善针对此类事件的应急响应协议。
材料和方法
本研究是对低温储罐在常规和真空损失条件下的性能进行的多中心调查。用于这项研究的储罐是捐赠的，因为使用新的和多个储罐是禁止的;本研究中捐赠的任何储罐的使用均不适用纳入或排除标准。这些储罐的特性如表所示。
没有人类受试者参与，也没有使用或挖掘患者PHI数据。材料、监测设备和冷冻储罐不会直接影响患者护理;因此，没有征求内部审查委员会的批准。
这项研究的一个公认的局限性是，纳入了之前可能怀疑或已经证明液氮蒸发增加的储罐。没有对每个储罐进行重复评估，也没有对低温储罐性能进行比较统计;数据是描述性的，旨在为理解低温储罐真空故障的性能特征提供基础数据。
所有参与者使用相同的研究方案来促进一致性，同时认识到不同的储罐在诱导真空损失前后可能具有不同的性能特征;无法控制的变量包括罐体的年龄和每个罐体的先前性能历史。
该研究由三个部分组成，旨在确定(1)满罐、(2)几乎空罐和(3)真空度因钻真空口而受损的几乎空罐的静态蒸发率。这些速率与制造商公布的速率进行了比较(如有)。每天或每小时监测储罐的总重量和温度。为了在英制和公制以及重量和体积之间进行转换，使用了磅到克的标准转换(453.6克/磅)，然后使用液氮的密度(0.807克/毫升)转换为体积。进行了额外的实验，以确定在真空损失后对大容量罐和干燥氮气托运器做出反应所需的时间。
测定完整储罐中液氮(LN2)的静态蒸发速率
每个低温储罐(大容量查特1840型储罐除外，见下文)都配备了一个温度探头，该探头连接到Onset Hobo UX100-014M高容量数据记录器。对于小容量罐，探针尖端的放置精确地延伸到塞子内表面下方2英寸，对于大容量罐，则延伸到顶部试样的水平(盖子底部下方约12厘米)。
在填充到边缘顶部之前，测量了储罐的空重，这样当插入聚苯乙烯泡沫塑料塞时，多余的液氮就会溢出。对装满的储罐进行称重，该数据点变为t0。为了确定满罐中的静态日蒸发率，记录了总共7天的罐重量。只有一个油箱配备了库存架(油箱3)。其他的是没有架子的罐体。
为了确定满罐和几乎空罐的蒸发率之间是否存在任何差异，通过将液氮移至6英寸的深度并重复重量损失测量进行了比较。值得注意的是，这些储罐是由于疑似故障或储罐老化可能即将发生故障而捐赠的。
在真空受损的小容量系统中测定液氮的静态蒸发速率
为了减少油箱从满到空的时间，对两个几乎空的油箱——一个MVE 47/11和一个旧的、停产的联合碳化物LR-31——进行了真空消耗测量。去除液氮，使每个罐中剩余6英寸。与之前的实验一样，除了在真空密封接头(VSJ)上钻一个1/8英寸的孔或锤击一个类似大小的钉子穿过VSJ，直到可以听到空气进入空隙的声音，绝缘真空屏障受到了损害外，储存容器的测量方式也是相同的。由于蒸发速率随着真空度的降低而急剧增加，因此每小时记录一次储罐和液氮内容物的重量，直到变空。
第三个储罐，即储罐3，是一个装有库存货架系统的MVE 47/11储罐。这是唯一一个在释放真空后蒸发速率从满到空的罐。
在真空受损的大容量系统中测定液氮的蒸发速率
在与较小的常规储罐类似的过程中，对液氮容量大于600升的大容量系统(查特工业MVE型号1840)在真空损失后的蒸发速率进行了测试。称量大容量系统存在几个后勤障碍，包括是否有足够容量的磅秤来测量600升系统的总重量，以及能否将其移入和移出磅秤。除了使用刻度尺手动进行液氮液位监测外，实验设计与较小储罐的设计相似。维萨拉HMT140高容量数据记录器用于记录温度。通过将温度探头放置在正常监测位置，刚好高于之前验证的最低液位，以产生-185°C的温度，即系统报警阈值，来获得温度测量值。储罐中的氮气液位设置在会引起报警的液位附近。一旦温度警报响起，测量就开始了。
真空密闭干式托运箱中液氮蒸发速率的测定
按照制造商建议的方法，将一个小型干式托运人(MVE SC4/3E)装满液氮。在测试前两小时，每15分钟向托运人加满液氮，以确保其处于完全充电状态。然后，它安装了两个温度探头，一个距离塞子2英寸，另一个距离底部6英寸。每小时测量一次油箱的重量，直到它与空油箱的重量相同。接下来，按照上述方法重新填充油箱，并用1/8英寸钻头钻VSJ来释放真空。每分钟记录一次温度，每小时记录一次重量，直到油箱达到室温。
结果
在真空受损的小容量系统中测定液氮的静态蒸发速率
小型储罐最显著的结果是，在钻孔以去除真空后的前6小时内，蒸发率从每天不到1升上升到每天至少40升(表1)。随着储罐液氮的耗尽，这一速率缓慢下降。较小的联合碳化物罐在真空损失后持续不到1天。罐2持续约18小时以完成蒸发，罐3也是如此(约18小时完成蒸发)，尽管罐3中的初始蒸发速率高于罐2。储罐2和储罐3之间的区别在于储罐3配备了库存货架系统。随着储罐中液氮的耗尽，平均蒸发速率(升/小时)略有变化。蒸发速率开始很高，然后在储罐中的液氮耗尽时降至零。在真空丧失3小时内，观察到盖子附近结霜和水珠。
小容量储罐的液氮蒸发速率。制造商声明的蒸发率为0.39L/天。真空失效3小时后，储罐的蒸发率为70L/天，失效6小时后达到最大蒸发率90L/天
罐体故障的最初迹象之一是罐体外部结霜和水珠。这张照片是小容量MVE 47/11和大容量MVE 1840
温度探头放置在顶部附近(2英寸以内)，靠近大多数储罐中试样的位置。在最小容量的储罐(LR-31;30 L)中，钻井后约8小时，下部探头的临界温度达到-130°C。在稍大的MVE 47/11中，储罐2在近27.6小时后达到临界温度，储罐3(带机架)在20小时后达到，而未钻井但失效的储罐4则需要35小时以上。
与氮消耗有关，在所有液氮蒸发后不久，临界温度很快达到。在罐2中，在排空后2小时内达到临界温度。在受损但完好无损的储罐4中，这发生在1小时内。
上探头(蓝线)和下探头(红线)的液氮体积(绿线)和温度图
为了了解这些储罐是如何制造的，我们切开其中一个储罐(储罐3)，检查颈部与内外储罐的连接(见图1)。
在真空受损的大容量系统中测定液氮的静态蒸发速率
在近700升的大型储罐中，从报警到试样达到-130°C的临界温度的时间约为15小时。从报警到液氮耗尽总共花费了近31小时。有趣的是，钻后蒸发率为31.4 L/天，仅为制造商列出的钻前蒸发率12.5 L/天的3倍左右。还观察到储罐盖上结霜。
钻探以释放真空的大容量MVE 1840的液氮使用量(蓝线)和温度(红线)
真空密闭干式托运器中液氮的静态蒸发速率
干式托运人的数据。在没有真空的情况下，罐的蒸发速率从0.15升/天增加到超过11升/天。静态保持时间从22.5天缩短到不到1天。故障发生约6小时后，储罐温度高于临界温度。
干燥托运箱的温度(蓝线)和液氮使用量(橙线)，通过钻真空口释放真空
讨论
最近，液氮储罐发生了两起广为人知的故障，促使那些储存人体组织的人重新审视这些组织在表面上是为储存公牛胚胎而设计的储罐中的安全性。鉴于这些失败，考虑设施在进行低温储存时面临的责任程度也是明智的[7]。迄今为止，几乎没有关于氮气储罐故障原因或故障时性能变化的报道。在这项研究中，通过在真空端口钻孔并允许真空逸出，捐赠储罐的真空隔热性能被破坏。在三种类型的罐中测量了真空去除前后液氮的蒸发率：小容量储存、大容量储存和干式托运。
这项研究存在公认的局限性，包括捐赠的储罐因年龄而异，其中包括一些预先存在较高液氮蒸发率的储罐，这些储罐被归类为故障储罐。作者还认识到，本研究可能无法证明或反驳轶事观察或猜测;但事实证明，这些轶事中有许多是真的;液氮的快速和不可预测的损失、储罐的个体性能特征以及外部故障指标，例如霜冻、水珠、空气通过损坏部位的声音运动等。
无论如何，这项研究提供的数据是独一无二的，应该保守地看待，在情况允许的情况下，作为个别诊所进一步探索的基础数据。
除大容量托运人外，所有储罐的初始制造商蒸发率均低于每天1升。当将实际蒸发率与制造商的蒸发率进行比较时，所有储罐的蒸发率都略高。这很可能是因为这些储罐要么已经使用了多年，要么由于液氮蒸发率随时间的推移而逐渐增加，预计储罐会发生故障。在通过钻出真空端口释放真空后，液氮蒸发速率在小型和大型储罐中急剧增加到每天30至40升，在相当小的氮气运输船中增加到超过12升。这种蒸发速率意味着，在真空损失发生后，小型液氮罐将容纳氮气24小时多一点，而在干燥的托运人中则不到6小时。
值得注意的是，两个非常相似的储罐(储罐2和储罐3)在故障后的蒸发率存在差异。储罐3的平均蒸发速率要高得多(见表)。这两个罐体都是MVE 47/11型，但请注意，罐体3配备了完整的存储架系统：罐子、手杖和高脚杯，以模拟完整的库存。该储罐(空)的基重为33.6磅和44.8磅(带机架系统)，液氮填充后为122.8磅;该罐在诱导真空故障之前被描述为功能齐全，并于1990年制造(5)。机架系统的额外质量以及随之而来的液氮的位移有效地减少了储罐3中的液氮量，并可能影响了储罐3的初始和平均蒸发速率。这是一个关键的发现和推测，需要更多的测试，尽管储罐3中液氮完全耗尽的时间与储罐2相似。
我们还观察到，只要罐中有一些液氮，组织附近的温度就会保持在约-130°C的临界玻璃化转变温度以下。一旦液氮消失，温度将在大约90分钟内迅速升至室温)。甚至在真空破裂后，储罐顶部附近的温度变化也非常缓慢。这对于如何设置触发警报的探测器具有至关重要的意义。至少有一家制造商销售用于低温罐的温度报警探头，该探头被编程为在探头达到-150°C的温度时报警。我们的研究表明，对于这种报警器的大多数应用，它放置在聚苯乙烯泡沫塑料塞下方约2英寸处，在试样有失透危险之前，报警器只会在大约1.1小时内发出声音。对于许多诊所来说，这可能没有足够的时间开车去实验室抢救标本。
尽管本研究中未对液位报警或其他机制进行评估，例如监测储罐的重量，可能比温度报警更有效，但应彻底测试任何报警系统是否发生故障，以确保它为发生故障的储罐提供足够的响应时间。我们的研究表明，如果可以通过氮气液位报警器或可以测量储罐重量的设备检测到氮气蒸发的早期增加，那么响应时间大约为18小时——只要有一个装有液氮的备用储罐可用，就足以处理大多数紧急情况。应使用至少一个位于实际试样深度附近的温度探头，以便能够证明试样没有暴露在允许失透的次优温度下。
同样重要的是要注意，由于干燥托运人储存的液氮体积较小(约3.4升)，他们的等待时间相对较短。这些容器中的真空损失可能会导致整个水箱在5或6小时内变干。其中一位作者(KP)观察到一个事件，一个全新的干燥托运人将组织运送到几百英里外的另一家诊所。罐体到达时，天气温暖干燥。水箱失灵了，珍贵的组织无法存活。当测试这个新罐时，发现它的氮气蒸发率过高，很可能是由于制造不善。
总之，当一个满的小容量水箱发生泄漏时，人们有大约18小时的时间来检测故障并抢救组织。这假设正在对储罐进行监测，以便它们可以检测到前3小时内发生的蒸发率增加。位于储罐顶部附近的温度探头似乎不足以快速检测出发生故障的储罐。人们需要一个系统来检测蒸发速率的这种快速变化或氮消耗的这种快速增加[8]。无论如何，整个系统——储罐、探头和报警器——都应该进行故障测试，以确定并确保足够的响应时间。小容量油箱非常有效。只要罐中还有液氮，它们就可以将温度保持在玻璃化转变温度的临界温度以下。希望这项研究将提供急需的数据，以帮助制造商生产更安全的储罐，并改进工作实验室协议，从而避免类似的胚胎和卵子丢失事件。
