探索超低温冷冻对绵羊卵母细胞四跨膜蛋白CD9的
时间:2019-08-06 10:06来源: 作者:ydgmve2020yyx 点击:
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1.卵母细胞的采集和体外成熟培养(IVM) MVE液氮罐 从屠宰场收集的新鲜绵羊卵巢，放在灭菌过并预热的37℃、0.9%生理盐水保温杯中，送到实验室。再用同样生理盐水清洗卵巢2～3遍，直至干
1.卵母细胞的采集和体外成熟培养(IVM) MVE液氮罐
从屠宰场收集的新鲜绵羊卵巢，放在灭菌过并预热的37℃、0.9%生理盐水保温杯中，送到实验室。再用同样生理盐水清洗卵巢2～3遍，直至干净。使用抽吸法吸取卵泡液，显微镜下筛取颗粒细胞紧密的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，放入预先加热的采卵液和成熟液各洗3次，放入成熟微滴中，CO2培养箱中培养23～24h。培养时间结束后使用透明质酸酶去颗粒细胞进行10～15min的消化。在显微镜下挑选形态完整、胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞。
2.卵母细胞的冷冻保存
BS、VS、ES预先在室温下平衡20min左右，再把处理好的细胞放入BS中稍微洗涤后就移入ES中停留5～10min，经过皱缩又复张到原先大小的80%为止，再移入VS后一并吸入冷冻管中，投入液氮罐中进行冷冻保存。
3.解冻
将1.0mol/L蔗糖溶液37℃预热20min，再将1.0、0.5、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分别放入预热的4孔皿中，室温下平衡20min。将冷冻细胞分别在上述梯度蔗糖溶液中分别放置3min，最后转入BS中，缓慢升温5min，即可进行下一步试验。
4.免疫组化
用预热的生理盐水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中，4℃固定24h，然后移入30%蔗糖溶液中脱水，脱水至卵巢在自然状态下下沉至底部即可。将处理好的卵巢放入冷冻切片机里冷冻30min，用O.C.T.包埋。切片厚度为10μM的卵巢放在防脱载玻片上放进PBS溶液中4℃过夜。用0.1%TritonX-100里通透30min，用PBS在脱色摇床上摇洗3次，每次10min。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1：100)(阴性对照加PBS代替一抗)中4℃过夜。经一抗孵育的切片用PBS摇洗3次，每次10min后室温摇床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1：200)孵育1～2h，再用PBS摇洗3次，每次10min。DAPI室温孵育5min，PBS摇洗3次，最后滴加抗荧光淬灭剂，即可荧光显微镜观察。
5.实时荧光定量PCR
(1)绵羊卵母细胞总RNA的提取 RNA提取依据微量样品总RNA提取试剂盒说明书进行。卵母细胞的收集同1.2.1、1.2.2和1.2.3步骤，各收集300个新鲜GV期、MⅡ期卵母细胞和冷冻GV期、MⅡ期卵母细胞，离心去上清加入350μL终浓度1%裂解液，再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液，匀浆，加入1倍体积70%乙醇，再将所有液体移入吸附柱crⅠ上放进离心管里，12000r/min离心1min，弃废液。加350μL去蛋白液，12000r/min离心1min，弃废液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液，室温放置15min加350μL去蛋白液，12000r/min离心1min，弃废液。再加500μL漂洗液，室温放置2min，12000r/min离心1min，弃废液。12000r/min离心2min，弃废液，置于室温数分钟以彻底晒干残余漂洗液。将吸附柱crⅠ放入新的离心管中，加入14μLrNAse-freeddh20，室温放置2min，13000r/min离心2min，所得溶液为RNA溶液。用酶标仪测定RNA的D260nm/D280nm值。
(2)总RNA反转录合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)试剂盒说明书，PCR反应总体系为20μL：5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL，rNA5.5μL，rNAse-freeddh2O10.5μL。轻轻混匀，37℃15min，85℃5s，温度降到4℃终止反应，-80℃保存。
(3)实时荧光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ检测绵羊卵母细胞CD9基因的相对表达量。引物序列见表1 MVE液氮罐
PCR扩增体系20μL：SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL，ROXReferenceDye(50×)0.4μL，上、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL，RNAse-free ddH2O7.6μL，cdnA1μL。每个样品做3个技术重复和3个平行试验。PCR反应程序：95℃30s;95℃30s，61℃30s，72℃20s;95℃1Min，55℃30s;95℃30s。反应结束后根据所得ct值计算CD9mRNA的相对表达量，采用sAs软件中GLM进行方差分析，并使用邓肯氏多重比较，P<0.05为差异显著。
6.Western blotting分析 卵母细胞的蛋白提取采用了细胞总蛋白提取的方法。同1、2和3步骤收集新鲜GV期、MⅡ期卵母细胞和冷冻GV期、MⅡ期卵母细胞各500个，10000R/Min离心2Min，弃上清液。震荡至细胞沉淀完全扩散。加28μLRiPA裂解液，用超声波破碎仪破碎数秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制剂和2μLβ-巯基乙醇，整个过程均在冰上进行，最后加8μLSDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)充分混合后，95℃变性5Min。配制5%浓缩胶和12%分离胶，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在20MA电流、20MV恒压的条件下进行转膜，取出PVdF膜后放入封闭液中，室温摇床1～2h，以便去掉膜上的非特异性蛋白，提高目的蛋白与抗体的特异性结合。分别放入Anti-CD9Antibody(1：1000)和MsMAbtobEtAActin(1：2000)中，4℃过夜。取出与一抗孵育的膜，用洗膜液摇洗3次，每次10Min。再分别与CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1：2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1：2000)在室温摇床孵育1～2h，洗涤3次，每次10Min，dAb染色，观察结果。MVE液氮罐
从屠宰场收集的新鲜绵羊卵巢，放在灭菌过并预热的37℃、0.9%生理盐水保温杯中，送到实验室。再用同样生理盐水清洗卵巢2～3遍，直至干净。使用抽吸法吸取卵泡液，显微镜下筛取颗粒细胞紧密的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，放入预先加热的采卵液和成熟液各洗3次，放入成熟微滴中，CO2培养箱中培养23～24h。培养时间结束后使用透明质酸酶去颗粒细胞进行10～15min的消化。在显微镜下挑选形态完整、胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞。
2.卵母细胞的冷冻保存
BS、VS、ES预先在室温下平衡20min左右，再把处理好的细胞放入BS中稍微洗涤后就移入ES中停留5～10min，经过皱缩又复张到原先大小的80%为止，再移入VS后一并吸入冷冻管中，投入液氮罐中进行冷冻保存。
3.解冻
将1.0mol/L蔗糖溶液37℃预热20min，再将1.0、0.5、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分别放入预热的4孔皿中，室温下平衡20min。将冷冻细胞分别在上述梯度蔗糖溶液中分别放置3min，最后转入BS中，缓慢升温5min，即可进行下一步试验。
4.免疫组化
用预热的生理盐水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中，4℃固定24h，然后移入30%蔗糖溶液中脱水，脱水至卵巢在自然状态下下沉至底部即可。将处理好的卵巢放入冷冻切片机里冷冻30min，用O.C.T.包埋。切片厚度为10μM的卵巢放在防脱载玻片上放进PBS溶液中4℃过夜。用0.1%TritonX-100里通透30min，用PBS在脱色摇床上摇洗3次，每次10min。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1：100)(阴性对照加PBS代替一抗)中4℃过夜。经一抗孵育的切片用PBS摇洗3次，每次10min后室温摇床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1：200)孵育1～2h，再用PBS摇洗3次，每次10min。DAPI室温孵育5min，PBS摇洗3次，最后滴加抗荧光淬灭剂，即可荧光显微镜观察。
5.实时荧光定量PCR
(1)绵羊卵母细胞总RNA的提取 RNA提取依据微量样品总RNA提取试剂盒说明书进行。卵母细胞的收集同1.2.1、1.2.2和1.2.3步骤，各收集300个新鲜GV期、MⅡ期卵母细胞和冷冻GV期、MⅡ期卵母细胞，离心去上清加入350μL终浓度1%裂解液，再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液，匀浆，加入1倍体积70%乙醇，再将所有液体移入吸附柱crⅠ上放进离心管里，12000r/min离心1min，弃废液。加350μL去蛋白液，12000r/min离心1min，弃废液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液，室温放置15min加350μL去蛋白液，12000r/min离心1min，弃废液。再加500μL漂洗液，室温放置2min，12000r/min离心1min，弃废液。12000r/min离心2min，弃废液，置于室温数分钟以彻底晒干残余漂洗液。将吸附柱crⅠ放入新的离心管中，加入14μLrNAse-freeddh20，室温放置2min，13000r/min离心2min，所得溶液为RNA溶液。用酶标仪测定RNA的D260nm/D280nm值。
(2)总RNA反转录合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)试剂盒说明书，PCR反应总体系为20μL：5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL，rNA5.5μL，rNAse-freeddh2O10.5μL。轻轻混匀，37℃15min，85℃5s，温度降到4℃终止反应，-80℃保存。
(3)实时荧光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ检测绵羊卵母细胞CD9基因的相对表达量。引物序列见表1 MVE液氮罐
PCR扩增体系20μL：SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL，ROXReferenceDye(50×)0.4μL，上、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL，RNAse-free ddH2O7.6μL，cdnA1μL。每个样品做3个技术重复和3个平行试验。PCR反应程序：95℃30s;95℃30s，61℃30s，72℃20s;95℃1Min，55℃30s;95℃30s。反应结束后根据所得ct值计算CD9mRNA的相对表达量，采用sAs软件中GLM进行方差分析，并使用邓肯氏多重比较，P<0.05为差异显著。
6.Western blotting分析 卵母细胞的蛋白提取采用了细胞总蛋白提取的方法。同1、2和3步骤收集新鲜GV期、MⅡ期卵母细胞和冷冻GV期、MⅡ期卵母细胞各500个，10000R/Min离心2Min，弃上清液。震荡至细胞沉淀完全扩散。加28μLRiPA裂解液，用超声波破碎仪破碎数秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制剂和2μLβ-巯基乙醇，整个过程均在冰上进行，最后加8μLSDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)充分混合后，95℃变性5Min。配制5%浓缩胶和12%分离胶，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在20MA电流、20MV恒压的条件下进行转膜，取出PVdF膜后放入封闭液中，室温摇床1～2h，以便去掉膜上的非特异性蛋白，提高目的蛋白与抗体的特异性结合。分别放入Anti-CD9Antibody(1：1000)和MsMAbtobEtAActin(1：2000)中，4℃过夜。取出与一抗孵育的膜，用洗膜液摇洗3次，每次10Min。再分别与CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1：2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1：2000)在室温摇床孵育1～2h，洗涤3次，每次10Min，dAb染色，观察结果。MVE液氮罐
