种质资源设施保存之液氮超低温保存法

摘要：为了探讨液氮超低温保存技术广泛应用于园林花卉种子保存的可能性，对18个科47种花卉种子进行了液氮超低温保存研究。除了两种花卉种子进入液氮后炸裂外，其余45种花卉种子保存后都有一定发芽率，有些花卉种子保存后种子发芽率还高于保存前。MVE液氮罐

结果表明：?液氮超低温保存技术可以广泛应用于园林花卉的种子保存。?花卉种子在自然含水量状态即可存于液氮中。? 从液氮中取出后，采用35～40°C温水浴化冻有较高的发芽率。? 液氮超低温保存对一些花卉种子萌发表现出促进作用。

关键词：液氮超低温保存，种子，园林花卉，种质保存

我国具有丰富的园林花卉种质资源，它们是我国园林发展的重要物质基础。但是目前保护力度不够，大量优良的种质不断丧失。与国外多层次、高安全系数、多种技术并存的种质保存体系相比，更是有较大的差距。因此，研究园林花卉种质保存技术研究有重要意义。

液氮超低温保存是一种新的生物技术，应用于植物种质资源保存实践仅20多年的历史。它是采用一定的技术将植物材料安全保存在液氮(-196oC)中，需要时采用一定方法使之回到常温并正常生长的一整套生物技术。被认为是目前实现生物种质永久保存的唯一途径而广泛应用。目前已成功应用于植物种子、花粉、器官、组织及悬浮细胞等组织培养物的保存。但是目前国内外针对园林花卉种子的液氮超低温保存技术研究不多，主要集中在农作物和蔬菜上。

为了探讨该技术在园林花卉种子保存中应用的可能性和广泛性，本实验对18个科47种花卉种子进行了液氮超低温保存研究，旨在探讨这些花卉种子液氮超低温保存的技术方法和该技术应用的广泛程度。

1、材料与方法

1.1 材料

供试花卉种子购于北京仁生制种公司。目录如下：

 

 

1.2 方法

1.2.1 花卉种子含水量的测定

参照，用烘干法测定种子含水量。重复两次，差值不超过0.02%。

1.2.2 花卉种子干燥方法

采用用硅胶干燥法。将种子放入盛有硅胶的干燥器中，根据种子含水量及脱水速度，确定放入不同时间以降低其含水量，达到所要求的种子含水量时取出供实验用。

1.2.3 种子液氮超低温保存方法

将种子放入Effendorf 试管中，每份30～50粒，盖紧盖子，直接投入液氮(-196oC)中。10min 后将种子从液氮中取出解冻。采用快速或慢速两种化冻方法。快速化冻是将种子在40oC温水浴中放置6～7min。慢速化冻是将种子置于25±2 oC的室温中30min 左右。

1.2.4 种子发芽率的测定

中、小粒花卉种子在30oC温水中浸种24h，微粒种子在湿滤纸上放置过夜，然后在发芽箱中萌发。为方便对比，每个萌发芽皿中一半放置对照组种子，另一半放置液氮保存后化冻的种子，每份各30粒。重复两次。

记录10天内种子萌发数，然后计算萌发种子数占种子总数的百分比为种子发芽率。发-2-1芽条件：18oC ，光照强度50umol/ms，相对湿度93%。

2、结果与分析

2.1 花卉种子液氮超低温保存结果

液氮超低温保存技术实验研究中，以实验材料进入液氮后一定时间，取出后材料有一定的生活力来判定保存方法的成功与否 。存入液氮的时间从5min.到几天甚至几年不等，本实验中放置10min ，除羽叶茑萝和银边翠种子进入液氮后炸裂外，其余45种花卉种子经液氮处理后都有一定的发芽率。表明这些花卉种子实现了液氮超低温保存。液氮保存对花卉种子发芽率的影响见表2。

从表2中可以看出，液氮保存对花卉种子发芽率影响不同。与对照组相比，有些花卉种子发芽率提高，而有的降低;不同的花卉种子与对照组种子发芽率的差异也不同。提高者(编号1～21的花卉)从高于对照组1%(凤仙花、粉红鸡冠、千日红、蛇目菊)～28%(彩叶草)不等,占实验用液氮保存成功花卉总数的46.7%;其中种子发芽率高于对照组5%以上的花卉占总数的24.4%，高于对照组10%以上的花卉占总数的11.1%。降低者(编号22～45的花卉)从低于对照组1%(石碱花)～31%(硫华菊)不等，占实验用液氮保存成功花卉总数的53.3%;其中种子萌发率低于对照组5%以上的花卉占37.8%，低于对照组10%以上的花卉占17.8%。即液氮保存后花卉种子发芽率与对照组差异在5%以内的花卉约占总数的37.8%，而62.2%的花卉种子发芽率较明显高于或低于对照组(差值在5%以上)。

结果表明，液氮超低温保存后种子发芽率与种子保存前花卉种子自身发芽率有很大关系。超低温保存对花卉种子发芽率也有一定影响。对一些花卉种子萌发有明显促进作用，如彩叶草提高了28%、矮秋葵提高了17%、飞燕草和‘五彩翠菊’提高了14%、;而使另一些花卉种子发芽率明显降低，如硫华菊降低了31%、早小菊降低了22%、矮雪轮降低了21%、金光菊降低了18%、观赏罂粟和大花牵牛降低了16%、金鱼草降低了15%。但71.1%的花卉种子液氮超低温保存前后，种子发芽率与对照组相比，差值在10%以内。说明液氮超低温保存方法是适合园林花卉种子保存的。

 

 

 

2.2 种子含水量对液氮超低温保存后种子发芽率的影响

液氮超低温保存中，所保存材料的含水量一直是人们给予特别重视的方面，认为它可能是超低温保存成败的关键因子，不同的植物种子都有一个适宜的含水量范围。实验中对自然含水量的花卉种子进行干燥，然后进行液氮超低温保存实验，结果见表3。

 

 

表3结果显示，液氮超低温保存对干燥过的花卉种子发芽率的影响与对自然含水量种子一致，既液氮超低温保存后有些花卉种子发芽率高于对照组(带#者)，而大多数(58.3%)降低(带*者)或不变(5号天人菊)。而自然含水量种子经液氮超低温保存后发芽率降低者达53.3%(见表2)，表明液氮保存不论是对干燥过种子亦或是对自然含水量种子质量都有一定影响，使大多数种子发芽率降低。

表3还可以看到, 对照组花卉种子从自然含水量干燥到一般低温保存所要求的安全含水量4%～8%左右时，种子发芽率呈三种不同变化趋势。表3中羽衣甘蓝等编号1～6 的花卉，其种子干燥后发芽率提高(从1%～11%不等)，这类花卉占该实验用花卉总数的28.6%(指种子含水量降到5%左右的花卉总数);编号7～9的硫华菊、麦秆菊、粉红鸡冠种子发芽率保持不变，这类花卉占总数的14.3%;大花牵牛等编号10～21的花卉种子干燥后，种子发芽率降低，(1%～42%不等)，这类花卉占总数的57.1%。结果表明约有半数以上花卉种子在从自然含水量向低温保存的安全含水量干燥过程中，发芽率会降低，说明干燥过程对大多数花卉种子质量有一定不良影响;而对一些花卉种子萌发则有促进作用或影响不大。编号22～24的花卉种子干燥到低温保存的安全含水量以下时(本实验为3.2%)，发芽率皆明显低于对照，表明过度干燥明显影响种子质量，降低发芽率。

但是干燥对种子发芽率的影响在液氮保存前后并不完全一致。本实验中1～21号花卉种子含水量降到5%左右，黑心菊、早小菊、硫华菊、麦秆菊、粉红鸡冠、金光菊6种花卉，液氮保存后种子发芽率皆高于液氮保存的自然含水量种子(带※者,从5%到22%不等)，似乎干燥有利于液氮超低温保存;而液氮保存前，干燥对这些花卉种子发芽率影响不同，使黑心菊、早小菊提高，没有影响硫华菊、麦秆菊、粉红鸡冠，降低了金光菊的种子发芽率。但71.4%的花卉种子干燥到含水量为5%时再进行液氮超低温保存，发芽率较自然含水量种子液氮保存后低，如石碱花，自然含水量为5.40%时，种子发芽率为6%，液氮保存后发芽率为5%;当种子含水量降到4.30%时，种子发芽率已下降到3%，液氮保存后发芽率为0，未能实现液氮超低温保存，见表3，似乎干燥不利于液氮超低温保存。这样的结果说明干燥和液氮保存这两个过程对种子发芽率影响的相对独立性和复杂性。但有一点可以肯定，对大多数花卉而言，干燥种子对液氮超低温保存后种子发芽率不利，即使干燥本身能提高种子发芽率。

花卉种子进一步干燥到含水量更低，情况与上述结果相似，见表3。 编号为22～24 的‘矮翠菊’、矢车菊、‘五彩翠菊’。当种子含水量降低到3.5%左右时，‘矮翠菊’和矢车菊种子发芽率明显低于对照组种子，但液氮保存后，‘矮翠菊’种子发芽率高于其对照组种子液氮超低温保存后种子发芽率，而矢车菊则明显降低。‘五彩翠菊’则表现出一致，即种子干燥后，发芽率由对照的64%升高到72%;液氮超低温保存后发芽率由对照组的78%上升到80%。

上述结果表明，花卉种子含水量对液氮超低温保存效果有一定影响。不同含水量花卉种子超低温保存后种子发芽率不同。有些花卉种子在自然含水量状态下进行液氮保存有较高的发芽率，而有些则进行干燥后进行液氮超低温保存有较高的发芽率。而干燥对种子发芽率影响在液氮超低温保存前后并不完全一致。

2.3 化冻方式对液氮超低温保存的影响

液氮超低温保存中，冰冻伤害有时在冰冻过程中不发生，但在解冻过程中发生。因此，化冻方法对液氮超低温保存技术研究非常重要。实验中采用种子从液氮中取出后在室温和温水浴中两种不同化冻方法。结果见表4。

从表4中可以看出，化冻方式对液氮超低温保存后种子发芽率有明显影响，温水浴化冻的种子，其发芽率高于室温化冻。仅就本实验用的花卉来看，花卉液氮超低温保存中，快速化冻优于室温化冻。MVE液氮罐