液氮保存胚胎脑组织与移植的实验研究

　　一、实验方法

　　正常妊娠15～21天的SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，在无菌条件下剖腹取胎，切取所需胎脑组织，制成1mm大小的组织块。用吸管将其移入含10%二甲基亚砜(DMSO)的无血清DMEM培养液中，装进冻存管，于4℃平衡1小时后置入-30℃冰箱。约1小时后标本温度降至-30℃(降温速率为0.5℃～1.0℃/分)，然后放入液氮中保存。需要时，取出冻存管于37℃水浴中复温，冰块熔化后再用Hank液以1∶1比例对冻存液反复稀释4次，每次3分钟。此时即可用于检测和移植。细胞存活率检测先采用胰酶消化制成细胞悬液，用0.4%台盼蓝染色1分钟，再按血球计数方法对死活细胞分别计数，求出细胞存活率。脑内组织移植分A、B两组进行，每组12只，分别进行新鲜组织移植和保存组织移植。两种组织均取自胎鼠顶叶，前者离开母体时间不超过20分钟，后者在液氮中保存30天。采用左顶叶皮层切开移植，每次植入3～5块组织。饲养6～8周后处杀，取脑，连续石蜡切片，进行HE、Nissl和嗜银染色。

　　二、结果

　　细胞存活率观察：不同部位组织在液氮中保存10天和30天，细胞存活率(%)大脑组织为67.78±4.46和65.14±4.55，小脑组织为68.93±5.67，脑干组织为71.07±7.43和69.63±1.99。经方差分析，三种组织之间细胞存活率差别不显著(P>0.05)，不同保存时间之间细胞存活率差别也不显著(P>0.05)。

　　脑内移植组织学观察：A组移植物成活例数7/12，移植物位于皮层下或伸入侧脑室，体积较大，周边有薄层胶质细胞反应带。移植物内是均匀分布的大型神经元和少量散在的胶质细胞。神经元核大，染色淡，核仁清楚，并可见到双核仁细胞，胞浆中尼氏小体丰富。移植物内有新生血管结构及比较致密的神经纤维网，在交界面上也有少量神经纤维。B组移植物成活例数2/10(2例感染不计)，移植物位于皮层下，体积小，呈散在的细胞团样，神经元核大淡染，胞浆不丰富。移植物内也可见到血管内皮细胞，嗜银染色见移植物中神经纤维稀少。

　　三、讨论

　　本实验考察了两步法梯度降温液氮保存胎脑组织的可能性。此法保存大鼠胎脑组织10天和30天平均细胞存活率在60%～70%。将新鲜的和保存30天的组织植入同种大鼠脑内，组织学检查发现两组都有移植物成活，但是与新鲜组织移植相比，保存的组织移植后移植物体积小，神经元数量少，胞浆不丰富，移植物内神经纤维少见，表明神经元分化较差。结果提示，用两步法梯度降温液氮保存胎脑组织可取得较高的细胞存活率，移植后也有一定的成活率，但是移植物成活质量明显不如新鲜组织移植。所以，这种保存方法能否实际应用还值得讨论和进一步研究。查特液氮罐