哲罗鲑精子冷冻保存分析

1材料与方法

1.1实验材料利用新疆伊犁河恰甫其海水库养殖的哲罗鲑(Huchotaimen)亲鱼21多尾，培育在(3×20)m2的长方形流水养鱼池中，进排水量约(15~20)m3/h，在水温达到8℃时对雄鱼注射促黄体生成素释放激素类似物(LRH-A2)2.5μg/kg和绒毛膜促性腺激素(hu-manchorionicgonadotropin,HCG)400IU/kg催熟，雄鱼成熟后采用挤压腹部法收集精液，采精时避免光线直射，将精液直接收集在50mL玻璃瓶中，置于事先放入冰块的保温盒中，带回实验室进行冷冻保存实验。MVE液氮罐

1.2精子稀释液的配制和筛选利用市售NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2、HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、KHCO3、KOH、MgSO4、KH2PO4、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、Tris、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、蛋黄、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)配制了9种精子稀释液和冷冻保存液：MPRS、RS、Hanks、ELS、EG1、EG2、Stein、SS-2、D15(表1)。分别利用以上精子稀释液以1：1的比例稀释精液，平衡5min后，利用OLYMPUS显微镜观察并统计精子活力(运动精子/全部精子数)。然后分别在以上稀释液中加入20%的DMSO，再以1：1的比例稀释精液，平衡5min后在显微镜下观察并统计精子活力。最后将稀释后的精液分装在2mL冷冻管中，每管注入稀释精液1.0mL，采用三步法冷冻保存在液氮中。冷冻3~4h后，利用37℃水浴解冻精子，在显微镜下观察并统计精子活力。

表1精子稀释液配方

 

1.3抗冻剂(甲醇和二甲基亚砜)浓度的筛选以ELS为稀释液，分别以终浓度为4%、6%、8%、10%和12%加入抗冻剂甲醇(methanol)和DMSO，稀释精液在加入冰块的保温盒中平衡20min后在显微镜下观察并统计精子活力。然后将稀释精液分装在2mL冷冻管中，每管注入稀释精液1.0mL，采用三步法冷冻保存在液氮罐中。冷冻3~4h后，利用37℃水浴解冻精子，在显微镜下观察并统计精子活力。

1.4葡萄糖浓度的筛选以D15为基础稀释液，在其中分别加入15%、20%、25%、30%、35%和40%的葡萄糖，再加入终浓度6%甲醇，以1：1的比例稀释精液，在加入冰块的保温盒中平衡20min后在显微镜下观察并统计精子活力。然后将稀释精液分装在2mL冷冻管中，每管注入稀释精液1mL，采用三步法冷冻保存在液氮中。冷冻5h后，利用37℃水浴解冻精子，在显微镜下观察并统计精子活力。

1.5哲罗鲑精子在不同稀释液中短期冷藏保存分别以D15、D30、Stein和ELS为稀释液，以1：1的比例稀释哲罗鲑精液，分别注入2mL冷冻管中，每管注入1.5mL，同时以未加稀释液的鲜精作对照，将冷冻管置于保温盒中，保温盒中事先放入体积1/3的冰块，保存温度2~4℃。每隔5h在显微镜下观察统计一次精子活力，直至精子完全失活。

1.6数据统计分析利用SPSS19.0统计软件对获得的数据进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，采用Student-Newman-Keuls进行多重比较和差异显著性分析，筛选精子活力最高的精子稀释液配方、抗冻剂成份和浓度。利用Excel软件对统计结果做图，在图中利用a、b、c后d等字母表示分析结果之间的显著性差异，字母相同为无显著性差异(P>0.05)，字母不同具显著性差异(P<0.05)。MVE液氮罐